MeiraGTx Holdings plc gab bekannt, dass das Unternehmen auf dem Jahreskongress 2023 der European Society of Gene and Cell Therapy (ESGCT), der vom 24. bis 27. Oktober 2023 in Brüssel, Belgien, stattfindet, acht Poster ausstellen und einen mündlichen Vortrag halten wird. Poster #122: Entwicklung von Alternativen zur Zelllyse mit Triton X-100 für die Primärgewinnung von AAV2, AAV5 und AAV8; Kategorie: AAV & nicht-integrative Vektoren; Triton X-100 ist ein wirksames Detergens für die Gewinnung biologischer Produkte aus intrazellulären Kompartimenten, aber seine Verwendung ist jetzt durch die Vorschriften zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH) verboten, da bei seinem Abbau eine Verbindung entsteht, die sich negativ auf das Leben im Wasser auswirkt. Ziel dieser Arbeit war es, alternative Methoden zu Triton X-100 für die Gewinnung von Adeno-assoziierten Viren (AAV) aus humanen embryonalen Nierenzellen 293 zu entwickeln, die REACH-konform und mit der Guten Herstellungspraxis vereinbar sind, die Produktqualität nicht beeinträchtigen und eine vergleichbare Produktgewinnung im Vergleich zur Lyse mit Triton X-100 aufweisen.

Zwei alternative AAV-Freisetzungsmethoden wurden für die Serotypen AAV2, AAV5 und AAV8 untersucht: 1) Eine detergenzienfreie hyperosmotische Freisetzungsmethode wurde zunächst im Mikroplattenmaßstab unter Verwendung eines zentralen zusammengesetzten Versuchsplans (Central Composite Design of Experiment) getestet, bevor sie auf den Maßstab eines 250-mL-Rührtankreaktors (STR) hochskaliert wurde. 2) Als dies nicht möglich war, wurde eine Lyse-Methode unter Verwendung von Deviron C16 Detergenz im 250 mL STR-Maßstab mit Konzentrationen von 0,1 bis 0,5% getestet. Schließlich wurden die erfolgreichen Bedingungen für beide Methoden auf den 10 L STR-Maßstab hochskaliert.

Für den AAV8-Serotyp wurde eine hyperosmotische AAV-Freisetzungsmethode unter Zugabe von 400 mM NaCl und 2-stündiger Inkubation angewandt, die zu einer VG-Wiederfindung von ~70% im Vergleich zur herkömmlichen Triton X-100-Methode führte. Für die AAV2- und AAV5-Serotypen erwies sich eine 0,5%ige Deviron C16-Lysemethode als am besten geeignet, die zu einer VG-Rückgewinnung von 87% bzw. 97% im Vergleich zur AAV-Freisetzung mit Triton X-100 führte. Für diese alternativen Methoden waren keine nachgeschalteten Prozessänderungen erforderlich.

Darüber hinaus waren beide Methoden auf 10 L STR skalierbar, und prozessbedingte Verunreinigungen, einschließlich Rest-DNA und Wirtszellproteine, sowie die Produktwirksamkeit wurden durch diese Methoden nicht beeinträchtigt. Zusammenfassend zeigt diese Studie zwei optimierte alternative AAV-Freisetzungsmethoden als Ersatz für die Verwendung von Triton X-100, die eine vergleichbare Produktausbeute und Produktqualität aufweisen. Poster #167: Potenztest-Zelllinienentwicklung für okulare Gentherapie-Vektoren; Kategorie: AAV & nicht-integrative Vektoren; Bei der Herstellung von GMP-AAV-Arzneimittelprodukten ist die Fähigkeit, ihre Potenz zu bewerten, ein wesentlicher Bestandteil der Freisetzung und Stabilität.

Zellbasierte Wirksamkeitstests sind eine regulatorische Voraussetzung für die Kommerzialisierung von AAV-Gentherapien, aber die schlechte In-vitro-Transduzierbarkeit von AAV sowie die Unfähigkeit, die Expression aufgrund der Verwendung gewebespezifischer Promotoren zu testen, behindern die Entwicklung effizienter und robuster Tests. Auch die präklinische Grundlagenforschung, in der einfach durchzuführende Tests für schneller durchzuführende Experimente und Iterationen wünschenswert sind, leidet unter den gleichen Einschränkungen. Das Unternehmen untersuchte daher, wie sich die Transduzierbarkeit des Vektors erhöhen und die Transaktivierung des Augenpromotors in den am häufigsten verwendeten Zelllinien (HEK293 und HeLa) erreichen lässt.

Das Unternehmen untersuchte verschiedene Methoden zur Erhöhung der Transduzibilität von AAV5- und AAV8-Vektoren sowie zur Transaktivierung von Photorezeptor-spezifischen (Rhodopsin-Kinase) und RPE-spezifischen (RPE65) Promotoren. In dosisabhängigen Experimenten identifizierten wir potente dCas9-vermittelte Transaktivatoren für beide Promotoren und etablierten eine exogene Faktorergänzung, die die Transduzierbarkeit beider Kapsiden um ein Vielfaches gegenüber dem Ausgangswert erhöhte. Weitere Studien werden es ermöglichen, diese in einer in vitro zellbasierten Potenz-Assay-Plattform für GMP-Chargenfreigabe und Stabilitätstests zu kombinieren.

Poster #324: Verwendung mechanistischer Modellierung zur Entwicklung eines Plattformprozesses für die Trennung von vollen und leeren AAV-Kapsiden; Kategorie: Herstellung Adeno-assoziierte Viren sind ein relativer Neuling auf dem Gebiet der biopharmazeutischen Modalitäten und werden verwendet, um ein therapeutisches Gen an einen Patienten zu liefern. Bei ihrer Herstellung werden getrennte zelluläre Prozesse eingesetzt, um das virale Kapsid und das therapeutische Transgen zu produzieren und das Transgen im Kapsid zu verpacken. Dies führt zur Expression von leeren Kapsiden, die während des nachgeschalteten Prozesses entfernt werden müssen, da sie beim Patienten eine Immunreaktion auslösen können.

Die Abtrennung von leeren Kapsiden stellt eine Herausforderung dar, da sich die Eigenschaften von leeren und vollen Kapsiden ähneln. Der Anteil der leeren Kapsiden kann stark variieren und je nach Reifegrad des vorgeschalteten Prozesses bis zu 90 % betragen, was die Abtrennung noch schwieriger macht. Die meisten Versuche haben sich auf den Einsatz von Anionenaustauschchromatographie konzentriert, um den Ladungsunterschied für diese Trennung zu nutzen.

Die veröffentlichten Ansätze sind jedoch sehr unterschiedlich, wobei einige Gruppen verschiedene Matrixtypen (Harze, Membranen und Monolithen), Prozessbedingungen und Additive verwenden. Das Unternehmen hat bereits gezeigt, dass eine schwache Partitionierung verwendet werden kann, um die Anreicherung der vollständigen Kapsiden zu maximieren, was die verfügbaren Optionen für diese Trennung weiter erhöht. Die Etablierung eines Plattformprozesses beinhaltet in der Regel das Screening einer Reihe von Optionen unter Verwendung von Heuristiken, um den Designraum einzugrenzen und den experimentellen Aufwand zu reduzieren.

Dies führt in der Regel dazu, dass Prozessoptionen unter suboptimalen Bedingungen verglichen werden, und es besteht das Risiko, dass die optimale Plattform nicht identifiziert wird. Diese Präsentation wird sich auf Arbeiten konzentrieren, die zeigen, dass mechanistische Modelle verwendet werden können, um einen optimalen Plattformprozess für die Anreicherung von AAV2-Vollkapsiden zu identifizieren. In dieser Studie wurden mechanistische Modelle für die Abtrennung von vollen und leeren AAV2-Kapsiden für drei AEX-Matrizen entwickelt, die sich zuvor bei der experimentellen Auswertung als vielversprechend erwiesen hatten.

Diese Modelle wurden dann verwendet, um eine Reihe von Prozessbedingungen (Salzkonzentrationen, Beladungsverhältnisse) und die Betriebsmodi (Binden und Eluieren, Durchfluss, schwache Partitionierung) zu untersuchen und die optimalen Bedingungen für jede Matrix zu ermitteln. Schließlich wurden die identifizierten optimalen Bedingungen experimentell verifiziert.